Harley Quinn, yang diperankan oleh Lady Gaga dalam Joker: Folie à Deux, merupakan karakter baru dalam sekuel ini. Dikenal sebagai pasangan dan partner-in-crime Joker, Harley Quinn pertama kali muncul di serial animasi Batman: The Animated Series pada tahun 1992, diciptakan oleh Paul Dini dan Bruce Timm.
Awalnya, Harley adalah Dr. Harleen Quinzel, seorang psikiater di Arkham Asylum yang jatuh cinta dengan pasiennya, Joker, dan akhirnya menjadi pendamping setia dalam tindakannya yang penuh kekacauan. Namun, di film ini, Harley digambarkan dengan lebih "grounded," dan karakternya dirombak agar lebih sesuai dengan dunia Joker yang lebih realistis.
Dalam Folie à Deux, Harleen Quinzel bukanlah Harley Quinn yang penuh humor dan tingkah laku eksentrik seperti dalam versi komik atau film lainnya. Dia adalah pasien di Arkham State Hospital yang awalnya penasaran dengan Arthur Fleck dan perlahan menjadi terobsesi. Hubungan mereka berkembang menjadi ikatan yang berbahaya, penuh manipulasi dan cinta yang salah arah. Phillips memfokuskan karakter Harley ini pada sisi gelap kepribadiannya, menghapus beberapa ciri khas Harley yang lebih kartun, dan menggambarkannya sebagai individu yang amoral dan licik.